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蛋白表達實驗過程可能遇到的常見問題分析

更新時間:2021-01-14點擊次數:1539
   蛋白表達實驗過程可能遇到的常見問題有哪些呢?我們應該怎么處理呢?
  一、蛋白不表達或表達量很低?
  1.選擇正確的表達載體和表達菌株
  T7啟動子的載體應選用BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Transetta(DE3)等菌株。非T7啟動子的表達載體應選用BL21表達菌株。
  2.嘗試不同的表達載體與菌株
  不同的蛋白,對不同載體與菌株的偏好不同,如果某一表達蛋白無法通過優化誘導表達條件得到明顯改善,可以更換其他菌株或表達載體。
  3.表達條件的優化
  選擇不同的培養基。對于某些蛋白,在培養基中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%),可以明顯提高表達量。
  較高的溫度、較高的誘導物濃度、較長的表達時間,一般可以加快表達的速度,促進目的蛋白的積累,從而提高表達量。但可能會降低可溶蛋白的表達量,形成包涵體。
  細胞的生長狀態對蛋白表達有很大的影響,可以通過測量菌液的OD600值監測生長狀態。對于大部分蛋白,應在菌株的對數生長期(OD600=0.5)進行誘導。
  二、目的蛋白大小不正確?
  蛋白的結構對判斷分子量大小有一定影響??梢酝ㄟ^加熱變性蛋白,從而準確判斷蛋白大小。確認蛋白表達是否完整,蛋白是否提前終止表達。若形成二聚體甚至多聚體,可以通過加熱變性蛋白打開二硫鍵(加入DTT、β-ME等還原劑)等手段,破壞次級結構,準確判斷分子量大小。
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